PREPARACION DE TEJIDOS
La Técnica Histológica abarca varios procedimientos a los que se somete un tejido para proporcionar los cortes como se conocen, montados bajo un cubre objeto con imágenes de estructuras contrastadas, para su estudio bajo microscopía óptica o electrónica. Para la obtención de cortes para observar a microscopio, hay que seguir un protocolo en el que se incluye la obtención de la muestra, su corte y montaje.
1. Para empezar con la técnica histológica se debe obtener una muestra del tejido.
2. Fijación: Este proceso se refiere al tratamiento del tejido con sustancias químicas, de manera que mantenemos las células con las propiedades intactas lo mejor posible. Esto se logra al inactivar ciertas enzimas celulares que de otra manera iniciarían la autolisis y llevarían a la DEGENERACIÓN POST MORTEM. La fijación mantiene las estructuras al estimular la formación de enlaces cruzados entre las proteínas.
3. Lavado: Se hace para eliminar el exceso de fijador, de manera que podamos luego hacer la inclusión sin interferencia por parte del fijador. Existen medios de inclusión que son hidrófobos y precisan de la eliminación de agua en la muestra. Tenemos pues que hacer una deshidratación. Debido a que una gran parte del tejido está constituido por agua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor grado de agente deshidratante, por ejemplo, Alcohol Etílico o Acetona. Iniciando con alcohol al 0,5%, luego con una solución de 10%, 20%... 80%, 90%, 95% y alcanzando de manera paulatina el alcohol al 100 % para eliminar el agua. Esto se hace por que si se colocara el tejido en una solución al 100% de alcohol inmediatamente, el agua saldría muy rápida del tejido y se deformaría.
4. Aclaramiento o diafanización: Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución de una sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusión a utilizar (en la mayoría de los casos se utiliza como medio de inclusión Parafina líquida). La sustancia comúnmente utilizada es el Xileno o Xilol. De la misma manera se coloca la muestra de tejido en un recipiente de Xilol, que solo es soluble en alcohol al 100%. Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de refracción. También se pueden utilizar Tolueno, Benzol o Cloroformo como medios de aclaramiento.
5. Inclusión: Los tejidos son estructuras blandas y frágiles, incluso después de la fijación. De tal forma que previo a la obtención de los cortes, es necesario incluirlos en un medio de soporte. Los medios más utilizados son las ceras o resinas. En estado líquido, estos medios tienen la capacidad de penetrar y rodear el tejido, de esta forma se puede producir el endurecimiento (por enfriamiento o por polimerización), para formar un bloque sólido que pueda ser cortado fácilmente en el microtomo. El objetivo de la inclusión es hacer facilitar la sección del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz y ser examinados mediante el microscopio. La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusión en estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido. Por lo general se coloca la muestra de tejido en un recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60º C, colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a 6 horas manteniendo la temperatura a 60º C.
6. Corte: El taco ahora se puede cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir el paso de la luz. La mayor parte de los preparados para microscopía óptica tienen un grosor entre 5 a 10 micrómetros. Para estos cortes se utiliza un aparato llamado MICROTOMO, con cuchillas de acero.
7. Montaje: Si queremos fijar las muestras una vez cortadas a un portaobjetos para observar a microscopio óptico, utilizamos 2 métodos de montaje:
Baño termostatizado: Consiste en una cubeta dentro de la cual nos encontramos con la solución de montaje, que en nuestro caso está formada por gelatina 1% a 38ºC que hace la función de adhesivo de la muestra en el portaobjeto.Cuando cortamos al microtomo, obtenemos una tirita con los cortes, pegados por los extremos. Esta tirita se pone flotando sobre la solución de montaje. El corte se irá extendiendo ligeramente, eliminándose las arrugas y pliegues debidos al corte, pero no se llegará a derretir, porque la temperatura de la gelatina no alcanza el punto de fusión de la parafina. Luego, con un portaobjetos “pescamos” las muestras. De esta manera obtenemos en un mismo porta varios cortes del mismo bloque o taco de inclusión. Los portaobjetos llevan un tratamiento de limpieza antes de utilizar para permitir mejor la adherencia de los cortes. Por tanto, se lavan antes con agua y jabón y finalmente con agua destilada. Y se guardan con éter y alcohol al 50% en un frasco.
8. Coloración: Indispensable que las muestras sean transparentes o muy claras, y como utilizaremos microscopio compuesto, tenemos que colorear o contrastar. Para teñir un corte de parafina, previamente eliminamos la parafina porque es insoluble en agua, y lo hacemos con un solvente orgánico como tolueno, xiloL.
. Tinción De Hematoxilina y Eosina Es el metodo de coloracion mas empleado, colorea los componentes el nucleo azul-violeta y las estructuras citiplasmaticas de color rosado Hematoxilina: colorante basdico Eosina: colorante acido La coloración H Y E es capaz de diferenciar el núcleo del citoplasmas: Núcleo: Forma y estructura interna. Citoplasma: Forma y extensión.
LINKGRAFIA
este blog es muy interesante ya que nos muestra detalladamente todo el procedimiento que se necesita para la preparacion de tejidos, asi tambien es didactico ya que contiene gráficos.
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